Supplementing conventional slow freezing or vitrification media with recombinant heat shock protein HSPA1A increases the cryoresistance of dog epididymal spermatozoa

Las proteínas de choque térmico (HSP) desempeñan un papel fundamental en la protección celular frente al estrés térmico gracias a su acción como chaperonas moleculares. Se ha demostrado que la HSPA1A, una isoforma inducible de la familia HSP70, protege a los espermatozoides durante la criopreservación estabilizando las proteínas desnaturalizadas, previniendo la agregación proteica y manteniendo la proteostasis. En este contexto, el presente estudio evaluó el efecto de la proteína HSPA1A recombinante sobre la criorresistencia y la criosupervivencia de espermatozoides epididimarios de perro sometidos tanto a congelación lenta convencional (CS) como a vitrificación cinética (VIT). La HSPA1A bovina recombinante (Bos taurus) se produjo en el Laboratorio de Biología Molecular de la Universidad de Cuenca (Cuenca, Ecuador), utilizando un modelo de expresión bacteriano (Escherichia coli Rosetta 2 DE3: pET15b-HSPA1A) y se purificó mediante cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC). La proteína se dializó en PBS 1× (pH 7,4) a una concentración de 2,5 mg/ml. Veinte perros adultos fueron orquiectomizados bilateralmente y se recuperaron 40 muestras de espermatozoides epididimarios mediante lavado retrógrado con medio TCG-EY (Tris, ácido cítrico, glucosa y yema de huevo al 20%). Las muestras de espermatozoides epididimarios de los testículos izquierdos (n = 20) se congelaron y las de los testículos derechos (n = 20) se vitrificaron. Se establecieron cuatro tratamientos por perro según la adición de HSPA1A al medio (10 μg/ml o 0 μg/ml [control]) y el método de criopreservación: CS + HSPA1A, CS-control, VIT + HSPA1A y VIT-control. Las muestras de CS + HSPA1A (n = 60) y CS-control (n = 60) se congelaron convencionalmente, añadiendo 5 % de glicerol al medio TCG-EY y exponiendo las muestras de esperma (en pajuelas de 0,25 ml) a vapores estáticos de nitrógeno líquido (LN₂). Mientras tanto, las muestras de VIT + HSPA1A (n = 36) y VIT-control (n = 36) se vitrificaron añadiendo 250 mM de sacarosa al medio TCG-EY y sumergiendo directamente gotas de 30 μL en LN₂ (almacenadas en crioviales de 2 ml). Se utilizaron un ANOVA factorial y pruebas de comparación múltiple post hoc de Tukey para evaluar los efectos de la adición de HSPA1A y el método de criopreservación sobre la cinemática espermática, la integridad de la membrana plasmática y acrosómica, la integridad del ADN y los índices de criorresistencia (CR = [valor después de la criopreservación/valor antes de la criopreservación] × 100) para la motilidad, la viabilidad y la integridad acrosómica. Los resultados mostraron que tanto los tratamientos con CS+HSPA1A como con CS-control produjeron un CR más alto para la motilidad, la viabilidad y la integridad acrosómica en comparación con VIT+HSPA1A y VIT-control (P < 0,05). Al comparar los tratamientos CS+HSPA1A y VIT+HSPA1A con sus respectivos controles CS y VIT, se observó una mejora significativa (P < 0,05) en los porcentajes de motilidad (55,2 ± 1,8 y 44,9 ± 1,4 frente a 37,5 ± 1,5 y 27,9 ± 1,4), viabilidad (56,2 ± 1,6 y 46,8 ± 1,7 frente a 42,8 ± 1,7 y 28,4 ± 1,4) e integridad del ADN (96,7 ± 0,9 y 98,3 ± 0,7 frente a 84,9 ± 3,3 y 85,7 ± 2,2), así como en los valores de CR. Cabe destacar que las muestras de CS+HSPA1A mostraron una integridad acrosómica superior a la del control de CS (P < 0,05). En conclusión, la adición de la proteína HSPA1A recombinante a los medios de congelación lenta convencional y de vitrificación cinética mejoró la criorresistencia de los espermatozoides al mejorar la motilidad, la integridad de la membrana y la integridad del ADN tras la criopreservación.